Chlamydiaceae sind gramnegative, nur 0,2 µm große, intrazelluläre Bakterien, die ein breites Spektrum an Erkrankungen bei Mensch und Tier auslösen können. Das Problem bei der Darstellung derart kleiner Partikel mit einem Durchflusszytometer ist, das sie kleiner sind als die Hälfte der anregenden Wellenlänge (488nm) und somit nicht sicher von den Streulichtparametern erfassbar (Vorwärtsstreulicht (FSC) und Seitenstreulicht (SSC)). FSC und/oder SSC werden normalerweise zum Triggern auf die durchfließenden Zellen benutzt. Um aber auf solch kleine Partikel in einem Durchflusszytometer sicher triggern zu können, ist eine zusätzliche Färbung erforderlich. Dafür bietet sich die Färbung der Bakterien-DNA an mit einem Farbstoff an, der die weitere Analyse nicht stört. Syto17, ein DNA Farbstoff von Molecular Probes (S7579), wird mit dem 633nm Laser angeregt und bei 660/20nm gemessen. Abb. 1 zeigt die Syto 17 Färbung der Chlamydien (EBs, metabolisch inaktive Elementarkörperchen) in einem Histogramm. Auf die Syto 17 Signale wurde in Verbindung mit dem SSC getriggert.

Abb. 1: Chlamydia pneumoniae (EBs) gefärbt mit Syto 17.

Abb 2: Partikel die im FACS gemessen werden können

Nachdem nun die Chlamydien-Partikel eindeutig identifiziert wurden, konnten weitere Analysen vorgenommen werden, indem verschiedene Oberflächenepitope untersucht wurden. Außerdem wurden die Chlamydien noch intrazellulär mit CFSE (CarboxyFluorescein diacetate, Succinimidyl Ester, Molecular Probes, C1157) gefärbt. CFSE markierte Chlamydien dienten auch dazu den Infektionsverlauf in Test-Zellen zu verfolgen.

Abb. 3: Gezeigt werden hier die Syto 17 gefärbten und auf Syto 17 und SSC getriggerten Chlamydien als Histogramme im FITC Kanal. A zeigt die negative Chlamydien Population ohne ein weiteres Reagenz. B zeigt ebenfalls negative Chlamydien, aber mit einem sekundären, FITC-gekoppeltem, Antikörper. C Positivkontrolle, mit CSFE gefütterte Chlamydien (intrazellulare Färbung). E Oberflächenfärbung von Chlamydien mit anti-LPS-FITC, ebenfalls positiv. D, F Oberflächenfärbung der Chlamydien mit den chlamydialen Proteinen 677 (D) und 678 (F) die beide FITC gekoppelt waren. Da Chlamydien (EBs, metabolisch inaktive Elementarkörperchen) stark infektiös sind, wurden alle Analysen mit gereinigten und Formalin fixierten Chlamydien durchgeführt.

Fluoreszenzmarkierte Einzelzellen in einem dünnen Flüssigkeitsstrahl werden durch einen oder verschiedene Laserstrahlen (kohärentes Licht) geführt (Analysepunkt) und die dabei emittierten unterschiedlichen Lichtsignale mit Hilfe mehrerer Photovervielfältigerröhren (PMTs, Photomultiplier tubes) in elektronische Signale verwandelt und als Messdaten gespeichert. Dabei werden jeweils die Impulshöhen, die Impulsflächen und die Impulsweiten der einzelnen Parameter bestimmt, digitalisiert und die Werte einem Computer zur Korrelation und quantitativen Auswertung übertragen. Selbst kleine Subpopulationen von seltenen Zellen können so identifiziert und in ein separates Röhrchen sortiert werden. Die erzielbare Reinheit beträgt etwa 100%. Gemessen werden zwei Datenarten: Streulichtparameter und Fluoreszenzparameter.

Referenzen
Gido Murra, Dissertation, 2009
Identifizierung und Charakterisierung von Adhäsionsproteinen des humanpathogenen Erregers Chlamydia pneumoniae

Molecular Probes: The Handbook
The Handbook