A

7-Aminoactinomycin D (7AAD)
Ein roter DNA-Fluoreszenzfarbstoff, der sich wie Propidiumjodid verhält und sich wie dieser (bei toten oder fixierten Zellen) in die DNA einlagert. Anregungsmaximum: 546nm (488nm), Emissionsmaximum: 647nm


Absorption
Das Aufnehmen / Aufsaugen von etwas, hier Licht. Meistens ein wellenlängenabhängiger Prozess wobei die aufgenommene Energie umgewandelt wird in Wärme oder Licht geringerer Energie also einer längeren Wellenlänge (Fluoreszenz).


Allophycocyanin (APC)
Allophycocyanin ist ein fluoreszierendes Protein aus dem Cyanobakterium Anabena variabilis und gehört zu den Phycobilliproteinen. APC kann gut mit einem Helium-Neon-Laser (633nm) angeregt werden und hat sein Fluoreszenzmaximum bei 660nm (Filter 660 / 20 nm). APC wird bei der Phänotypisierung eingesetzt.


Annexin V
Annexin V bindet calciumabhängig an die Phosphatidylserin-Reste von Zellmembranen und wird zum Nachweis der frühen apoptotischen Phase eingesetzt. Bei frühen apoptotischen Zellen, bei denen die Zellintegrität noch erhalten ist (PI negative Population), wird Phosphatidylserin von der Innenseite auf die Außenseite der Zellmembran verlagert. Eine Annexin V positive und gleichzeitig PI negative Population zeigt also eine frühe Phase der Apoptose an. Bei doppelt positiven Zellen (Annexin V + PI positiv) kann nicht mehr unterschieden werden auf welchem Wege die Zellen gestorben sind, auf nekrotischem Wege oder auf apoptotischem Wege. - Nekrotische Zellen werden auch Annexin V positiv.
Bei Hefen ist auch Apoptose nachgewiesen worden. Eine gute Darstellung von Apoptose bei Hefen mit einem FACS zeigt die Veröffentlichung von Wei Li et al. 2006.


Area
Integral des Messsignals

B

Bandpass (BP)
Ein optischer Filter mit einem definierten spektralem Durchlassbereich, der die anderen Bereiche blockiert (z.B. BP530/30 = Durchlassbereich von 515 bis 545nm).

C

Capping
Wenn Antigene oder Antikörper an eine Zelloberfläche binden, sich zu einer "Kappe" zusammenschließen und dann entweder abgeworfen oder internalisiert werden. Das "Cappen" kann bei einer Immunfluoreszenzfärbung, bei nicht ruhig gestellten Zellen, zu falsch negativen Ergebnissen führen.


CD (Cluster of Differentiation)
Bezeichnungen für Gruppen immunphänotypischer Oberflächenmerker von Zellen, die vom International Workshop of Differentiation Antigens festgelegt wurden.


CV (Coefficient of Variation)
Standardabweichung dividiert durch den Mittelwert x 100.


C-Wert
Der C-Wert oder Chromatinwert ist ein Maß für die Gesamtmenge an DNA eines haploiden Genoms in Picogramm (pg) wobei 1pg DNA = 0,978x109 Basenpaare entspricht (Dolezel et al. 2003). Differenzierte Zellen eines Organismus, die durch die Verdopplung der Kern-DNA ihre Gesamtmenge an DNA vervielfacht haben, werden in Ploidie-Stufen angegeben.

D

DAPI
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol, Dihydrochlorid) ist ein blauer, sehr hell leuchtender AT-spezifischer DNA-Farbstoff, der mit UV angeregt wird. Anregungsmaximum: 360nm, Emissionsmaximum: 460nm.

Dot Plot
Grafische Darstellung von zwei korrelierten Parametern wobei jedes Ereignis als ein Punkt entsprechend seiner Signalintensität dargestellt wird. Populationen zeigen sich dabei als Punktwolken.

E

Emission
Abgabe aufgenommener Energie in Form von Licht das langwelliger (energieärmer) ist, als die Anregungswellenlänge. Die Differenz von Anregungsmaximum zu Emissionsmaximum nennt man Stokes shift.

Epitop
Einzelne Antikörperbindungsstelle eines Antigens.


Event
Ein gemessenes Ereignis eines Partikels oder einer Zelle.

F

FITC
Die Abkürzung FITC steht für Fluorescinisothiocyanat. FITC ist ein grün fluoreszierender Farbstoff mit einem Anregungsmaximum von 495nm und einem Emmissionsmaximum von 517nm.


FSC (Forward scatter)
Vorwärts Streulicht, gestreutes Lichtsignal eines Partikels bzw. einer Zelle in Richtung der Verlängerung des anregenden Laserstrahls.


Flow Rate
Die Flow Rate oder Durchflussrate gibt die Anzahl der gemessenen Ereignisse (Events) pro Sekunde an.


Fluoreszenz
Eine Eigenschaft von Molekühlen - Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren und wieder zu emittieren bei einer längeren Wellenlänge (Stokes shift).

G

Gate
Eine definierte Region um eine bestimmte Population von Interesse, die als Tor (Filter) für weitere Untersuchungen oder auch zum Sortieren dieser Population bestimmt ist.


GFP (Green Fluorescent Protein)
GFP oder das Grün Fluoreszierende Protein ist ein fluoreszentes Protein das ursprünglich aus der Qualle Aequorea victoria isoliert wurde. GFP eignet sich besonders gut als transgener Marker zur fluoreszenten Darstellung einer spezifischen Gen-Expression.

H

Height
Maximum des Messsignals


Histogram
Grafische Darstellung eines einzelnen Parameters wobei jedes Ereignis (Event) seiner Signalintensität entsprechend dargestellt wird. Gleiche Signalintensitäten werden in vertikaler Richtung grafisch aufaddiert (counts). Durch die Verteilung der Signalintensitäten ergeben sich, im Idealfall, gaußverteilte Populationen.


Hoechst 33342
Hoechst 33342 (Bisbenzimide) ist ein blauer, sehr hell leuchtender zellpermeabler AT-spezifischer DNA-Farbstoff, der mit der UV angeregt wird. Hoechst ist heller als DAPI dafür aber weniger lichtstabil. Anregungsmaximum: 346nm, Emissionsmaximum: 460nm.


Hydrodynamische Fokussierung
Als hydrodynamische Fokussierung bezeichnet man einen Vorgang innerhalb der Düse eines FACS-Gerätes, bei der die Partikel oder Zellen aufgrund der Strömungsverhältnisse in der Mitte der Trägerflüssigkeit ausgerichtet werden. Dies wird erreicht indem viel Umhüllungsflüssigkeit (Sheath) die mittig ankommende Probenflüssigkeit (mit den zu analysierenden Partikeln) zu einem feinen Flüssigkeitsfaden (kleiner dem Zelldurchmesser) mittig auseinander zieht, dabei beschleunigt und längliche Partikel in Strömungsrichtung ausrichtet. Wie gut diese hydrodynamische Fokussierung funktioniert, hängt erstens von der möglichst geringen Menge der ankommenden Probenflüssigkeit ab und zweitens davon, dass laminare Strömungsverhältnisse in der Düse herrschen. Deshalb muss die Düse möglichst von allen Ablagerungen freigehalten werden, da bereits kleinste Verunreinigungen in der Düse die laminare Strömung stören kann.

K

Kompensation
Das anteilige Abziehen von übersprechender Fluoreszenz aus einem benachbarten Fluoreszenzkanal.


Kurzpass (Short pass, SP)
Ein optischer Filter, der die längeren Wellenlängen einer bestimmten Wellenlänge blockiert und die kürzeren durchlässt.

L

Langpass (LP)
Ein optischer Filter, der die kürzeren Wellenlängen einer bestimmten Wellenlänge blockiert und die längeren durchlässt.


LASER
Die Abkürzung LASER steht für "Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation" also für "Lichtverstärkung durch stimulierte Emission von Strahlung". Wichtig für die Durchflusszytometrie ist, dass der Laser kohärentes, monochromatisches Licht einer definierten Wellenlänge emittiert.

M

MACS
High-gradient magnetic cell sorting: Magnetisches Trennverfahren


Mean
Mittelwert: Summe aller Xi dividiert durch n

P

Photo Multiplier Tube (PMT)
Ein PMT ist eine Lichtsignal Vervielfacher Röhre, die durch Photonen eine Kaskade von Elektronen und somit ein messbares Signal erzeugt. Als Detektor dient ein PMT dazu die aufgefangenen Photonen der Fluoreszenzfarbstoffe und des SSCs in elektrische Signale zu verwandeln und zu verstärken.


Photobleaching (Photobleichung)
Als Photobleaching bezeichnet man den Verlust an Fluoreszenz eines Fluorophors durch die Bestrahlung mit dem Anregungslicht. Bei der Photobleichung werden Fluorophor-Moleküle, durch das Anregungslicht, photochemisch zerstört. Die Fluoreszenz verblasst, sie bleicht aus


Phycoerythrin (PE)
Phycoerythrin (PE) bzw. R-Phycoerythrin (siehe desgl.) ist ein fluoreszierendes Protein aus einer Rotalge und gehört zu den Phycobilliproteinen. PE kann sehr gut mit einem 488nm Laser angeregt werden und hat sein Fluoreszenzmaximum bei 575nm (Filter 558 / 42 nm). Aufgrund seiner Größe (240 kDa) wird jeweils nur ein PE-Molekül mit einem Antikörpermolekül gekoppelt.


Ploidie-Stufen
Mit Ploidie-Stufe oder Ploidie-Grad wird die Anzahl der vollständigen Chromosomensätze in einer Zelle bezeichnet. Ploidie-Stufen werden, da sie Potenzen von 2 sind, mit 2C, 4C, 8C, ... angegeben.


Propidiumjodid (PI)
Propidiumjodid (PI) ist ein roter, Membran impermeabler DNA-Farbstoff der zwischen die Basenpaare interkaliert. PI wird von lebenden Zellen ausgeschlossen und eignet sich daher gut zur lebend tot Unterscheidung. Da PI auch an dsRNA (doppelstränige RNA) bindet, ist eine RNAse Behandlung bei Zellkernen oder fixierten Zellen, notwendig. Anregungsmaximum: 536 nm, Emissionsmaximum: 617 nm

Q

Quantum yield
Quantenausbeute: Gibt die Effizienz des Energietransfers von der Absorption zur Emission der Fluoreszenz an.


Quenchen (Quenching-Effect)
Unter Quenchen / Quenching versteht man die Abnahme der Fluoreszenzintensität eines Fluorophors durch "Fluorescence resonance energy transfer" (FRET). Beim Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer wird Energie des angeregten Fluorphors (Donors) durch Resonanzeffekt auf ein zweites Fluorophor (Akzeptor) übertragen wodurch sich die Fluoreszenz des angeregten Fluorophors deutlich verringert. Dieser Effekt wird bei Tandemkonjugaten (z.B. PE-Cy5 oder PE-Cy7) ausgenutzt und erweitert die Anwendungsmöglichkeiten bei der Multiparameteranalyse.

R

R-Phycoerythrin (R-PE)
R-phycoerythrin kann sehr gut mit der 488nm Laserlinie angeregt werden (im Gegensatz zu B-phycoerythrin (B-PE)) und wird daher heute allgemein nur nach als Phycoerythrin (PE) bezeichnet.

S

Side scatter (SSC)
Seitenstreulicht oder 90º Streulicht, gestreutes Lichtsignal eines Partikels bzw. einer Zelle in 90º Richtung des anregenden Laserstrahls.


Stokes Shift
Differenz zwischen dem Maximum der Lichtabsorption eines Fluoreszenzfarbstoffes und dem Maximum der Emission.

T

Threshold
Signalschwelle eines Events von einem oder von mehreren Parametern bei dem der Messvorgang eingeleitet wird. Nur Partikel, die diese Bedingung(en) erfüllen, werden gemessen.

W

Width
Breite des Messsignals (Area/Height x 64K) - wird benutzt um Dubletten von Einzelzellen zu unterscheiden. Width wird auch als 'time of flight' bezeichnet.

Referenzen

Wei Li, Libo Sun, Qiuli Liang, Juan Wang, Weike Mo, and Bing Zhou; Yeast AMID Homologue Ndi1p Displays Respirationrestricted Apoptotic Activity and Is Involved in Chronological Aging; Molecular Biology of the Cell, 17, 1802, 2006

Dolezel, J., Bartos, J., Voglmayr, H. und J. Greilhuber, Letter to the editor: Nuclear DNA Content and Genome Size of Trout and Human. Cytometry Part A 51A, 127-128, 2003.

Andreas Radbruch; Immunofluorescence: Bacic Conciderations; Flow Cytometry and Cell Sorting, Second Edition, Editor A. Radbruch, Springer Verlag (2000)

Klaus L. Meyer, Isolierung von Antikörpern gegen Zelloberflächenantigene mit Hilfe des Fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortierers, Diplomarbeit, Köln, 1987