Der größte Vorteil eines Durchflusszytomerters ist die Korrelation mehrerer Zelleigenschaften mittels der Mehrfarbenfluoreszenz-Analyse (Multi-Color Analyse) auf Einzelzellniveau. Die Mehrfarbenfluoreszenz-Analyse ermöglicht die Korrelation mehrerer Zelleigenschaften und ist somit unerlässlich bei der Darstellung kleiner Subpopulationen, bei der Untersuchung der Zelldifferenzierung, der Zellproliferation und der Protein (Antigen) -expression. Neben der gemeinsamen Anregbarkeit der Farbstoffe müssen die einzelnen Emissionsmaxima deutlich voneinander getrennt sein, damit, bei der Messung mit den verschiedenen Detektoren (Photo Multiplier Tubes, PMTs), nur ein minimales Übersprechen benachbarter Fluoreszenzen möglich ist. Aufgrund der Profile der optischen Filter und der überlappenden Emissionsspektren (siehe Abb. 2) kann eine Kompensation (anteiliges abziehen der benachbarten Emissionsspektren) notwendig werden. Die meisten parallel eingesetzten Fluorochrome sind direkt an Antikörper gekoppelt aber auch an sekundäre Reagenzien wie z.B. Avidin aus Streptococcus (StrAv) und sie sind z.B. mit 488nm oder 633nm anregbar. Kombiniert werden können diese fluoreszenzmarkierten Antikörper mit biochemischen Markern wie z.B. Fluorescein diacetat (FDA, Esteraseaktivität) oder Chloromethylfluorescein-diacetate (CMFDA) und DNA Farbstoffen wie z.B. Propidiumjodid (PI) oder Chromomycin A3. Eine kleine Übersicht der Fluoreszenzfarbstoffe findet sich unter FACS Infos.

Hier ein Beispiel (Abb.3) für eine 7-Parameteranalyse mit fünf Fluoresenzfarbstoffen und 2 Lasern (488nm + 633nm). Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die zugehörigen Anregungsspektren bzw. Emissionsspektren.

Abb. 1: Die Abbildung zeigt die Anregungsspektren von Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Propidiumjodid (PI), dem Tandem-Konjugat PE-Cy7 und von Allophycocyanin (APC). FITC, PE, PI und PE-Cy7 werden bei 488 nm und APC bei 633 nm angeregt.




Abb. 2: Hier werden die Emissionsspektren von Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Propidiumjodid (PI), PE-Cy7 und Allophycocyanin (APC) gezeigt. Diese Farbstoffkombination ist gut einsetzbar da die Emissionsmaxima deutlich voneinander getrennt sind, PI nur zum Ausschließen toter Zellen dient und APC zeitversetzt vom 633nm Laser angeregt wird. Aufgrund überlappender Spektren muss zwischen FITC und PE kompensiert werden. Zwischen PE und PI braucht nicht kompensiert zu werden da PI nur zum Ausschließen der toten Zellen dient (Kato K. and A. Radbruch; Cytometry 14, 384 (1993)).

Die Laser-/Farbstoffkombination mit den verwendeten Filtern:

Mit Hilfe weiterer Farbstoffe ist es möglich, eine Mehrfarbenfluoreszenzanalyse (Multi-Color Analyse) mit 7 oder sogar 11 Fluoreszenzfarbstoffe durchzuführen (S.C. De Rosa et al., Nat. Med. 7, 245, (2001)). Der Vorteil einer Multi-Color Analyse ist, dass eine größere Analysetiefe erreichbar ist und somit weiterführende Erkenntnisse über Populationsverteilungen und Zelleigenschaften gewonnen werden können. Es ist möglich komplexe immunophänotypische Analysen mit funktionellen und biochemischen Analysen zu kombinieren. Wichtig dabei ist, das sog. "Gaten" (definieren einer Region) und die damit erzielbaren Zusammenhänge, zu zellulären Eigenschaften bzw. zwischen den Populationen, sichtbar zu machen.



Referenzen
Coffman R.L. and I.L. Weissman, B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature 289, 681, (1981) 

De Rosa, S.C., Herzenberg, L.A., and Roederer, M., 11-color, 13-parameter flow cytometry: Identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat. Med. 7:245-248 (2001)

Kimitaka Kato and Andreas Radbruch; Isolation and Characterization of CD34+ Hematopoietic Stem Cells From Human Peripheral Blood by High-Gradient Magnetic Cell Sorting. Cytometry 14:384-392 (1993)

Klaus L. Meyer, Isolierung von Antikörpern gegen Zelloberflächenantigene mit Hilfe des Fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortierers. Diplomarbeit, Köln, 1987