F A C S    A n d    M o r e

 

  

Analyse und Sortierung von Arabidopsis Zellkernen

zur Untersuchung zelltypischer Gen-Expression auf molekularer Ebene

 

Für die Analyse zelltyp-spezifischer Gen-Expression auf molekularer Ebene bieten sich fluoreszente Proteine an. Eines der bekanntesten ist das Grün Fluoreszierende Protein (GFP, green fluorescent protein), das ursprünglich aus der Qualle Aequorea victoria isoliert wurde. GFP eignet sich dafür besonders gut, da es als transgener Marker der Gen-Expression benutzt werden kann.

Hier ein Beispiel einer zelltyp-spezifischen Analyse der Gen-Expression von Arabidopsis thaliana mittels GFP unter einem zelltyp-spezifischen Promotor in Kombination mit der Analyse des C-Wertes (DNA Gehaltes) über Propidiumjodid (PI) (Abb.1, Abb.2 u. Abb.3). Dabei können die verschiedenen zelltyp-spezifischen Expressionsmuster mit den dazugehörenden C-Werten korreliert dargestellt werden, wie z.B. der zelltyp-spezifische Arrest in den verschiedenen C-Wert Stadien.
Die so gefundenen und definierten Zellkern-Populationen verschiedener Zelltypen können nun für weiterführende Untersuchungen sortiert werden.


 
Abb. 1:
Der Dot Plot (links), PI (Propidiumjodid) versus SSC (Seitenstreulicht), zeigt, mit der Zunahme der PI-Fluoreszenz, die steigenden Ploidie-Stufen von Arabidopsis Zellkernen gegenüber dem Seitenstreulicht. Die PI-Fluoreszenz ist dabei in etwa proportional dem DNA-Gehalt. Die verschiedenen Ploidie-Stufen werden als distinkte Populationen (Regionen P2 bis P8) definiert - entsprechend den Ploidie-Stufen C2 bis theoretisch C128. Wobei die Region P6 (Ploidie-Stufe C32) die letzte mit Sicherheit darstellbare Population ist. Für die Darstellung der Ploidie-Stufen C64 (P7) und C128 (P8) muss eine größere Anzahl von Ereignissen aufgenommen werden als insgesamt 5000, damit mehr als die 5 Ereignisse in P7 bzw. das eine Ereignis in P8 dargestellt werden können und somit mit Sicherheit Zellkernpopulationen erkannt werden können. Das PI-Histogramm (rechts) zeigt die gegateten Regionen P2 bis P8 aus der linken Dot Plot Darstellung. Es ist deutlich die unterschiedliche Expressionsverteilung der einzelnen Ploidie-Stufen (C2 – C32) der Arabidopsis Zellkerne zu erkennen.




Abb. 2:
Die in Abb. 1 definierten Populationen (P2 – P8) werden hier in einer PI versus GFP Darstellung unkompensiert gezeigt und die GFP positive Region P9 und die GFP negative Region P10 festgelegt. Der gleichmäßige Anstieg der Fluoreszenz im GFP-Kanal, verteilt über die Ploidie-Stufen (C2, C4, ...), ist auf die Größenzuname der Zellkerne zurückzuführen und bedeutet keine Zuname an GFP-Fluoreszenz wie deutlich an der Wildtyp Kontrolle (links) zu sehen ist. Somit definiert die Region P10 eindeutig den GFP negativen Bereich und die Region P9 den GFP positiven Bereich. Die deutlich GFP positive Region P9 steht für eine zelltyp-spezifische Expression die im Zellkern ausgeprägt wird und kann zum Sortieren derselben benutzt werden zu weiterführenden Untersuchungen auf molekularer Ebene (z.B. PCR).

 


  
 
Abb. 3:
Die in Abb. 1 definierten Populationen (P2 – P8) können auch als Histogramme zur Ermittlung des jeweiligen prozentualen GFP-Anteils der einzelnen Ploidie-Stufen dargestellt werden. Die oberen Histogramme zeigen den jeweiligen Wildtyp. Links die Histogramme aus den Regionen P4 (C8) mit dem positiven GFP-Anteil P13 (unten, links) und rechts die Histogramme aus den Regionen P5 (C16) mit dem GFP-Anteil P14 (unten, rechts).



Referenzen
Galbraith DW, Harkins KR, Maddox JR, Ayres NM, Sharma DP, Firoozabady E; Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. Science, 220, 1049-1051, 1983

David W. Galbraith; Global analysis of cell type-specific gene expression; Comparative and Functional Genomics, 4, 208 – 215, 2003

Changqing Zhang, Fang Cheng Gong, Georgina M. Lambert and David W. Galbraith; Cell type-specific characterization of nuclear DNA content within complex tissues and organs; Plant Methods, 1, 1-12, 2005