Was ist ein Durchflusszytometer oder FACS?
FACS (= Fluorescence Activated Cell Sorter) wird meist im Sinne von Durchflusszytometer benutzt und ist mit diesem austauschbar. Durchflusszytometrie ist eine Methode zur Analyse und Aufbereitung (trennen, aufreinigen) von Einzelzellen in Suspension auf der Grundlage von Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften. Das Prinzip des FACS ist von L.A. Herzenberg et al. (Sci. Am. 234, 108, 1976) ausführlich beschrieben worden (siehe auch Abb. 1). Die hohe Analysegeschwindigkeit und Empfindlichkeit ebenso wie die objektive Quantifizierung und die multiparametrischen Korrelationen eröffnen der Durchflusszytometrie ein nahezu unbegrenztes Anwendungsfeld in der Forschung und Diagnostik.
Grundvoraussetzung zur Messung mit einem Durchflusszytometer ist das Vorliegen der Probe als Einzelzellsuspension. Es sind Partikel mit einem Durchmesser von kleiner 0,2 µm unterscheidbar. Tabelle 1 gibt eine Übersicht über Anwendungen der Durchflusszytometrie


 Tabelle 1: Partikel die im FACS gemessen werden können
  • Blutzellen
  • Knochenmark
  • Tumorzellen
  • Pflanzenzellen
  • Zellkerne
  • Protoplasten
  • Hefen
  • Bakterien
  • Viren
 Bedingung: monodisperse Partikelsuspension

   
Abb. 1: Sortieren von grün und rot markierten Zellen.

Fluoreszenzmarkierte Einzelzellen in einem dünnen Flüssigkeitsstrahl werden durch einen oder verschiedene Laserstrahlen (kohärentes Licht) geführt (Analysepunkt) und die dabei emittierten unterschiedlichen Lichtsignale mit Hilfe mehrerer Photovervielfältigerröhren (PMTs, Photomultiplier tubes) in elektronische Signale verwandelt und als Messdaten gespeichert. Dabei werden jeweils die Impulshöhen, die Impulsflächen und die Impulsweiten der einzelnen Parameter bestimmt, digitalisiert und die Werte einem Computer zur Korrelation und quantitativen Auswertung übertragen. Selbst kleine Subpopulationen von seltenen Zellen können so identifiziert und in ein separates Röhrchen sortiert werden. Dabei wird eine Reinheit von etwa 100% erreicht. Gemessen werden zwei Datenarten: Streulichtparameter und Fluoreszenzparameter.

Die Lichtstreuung (light scattering) ist ein physikalischer Prozess, bei dem ein Partikel (eine Zelle) mit Licht interagiert. Dabei wird nur die Richtung, nicht die Wellenlänge (Farbe) des anregenden Lichtes verändert.
Zelleigenschaften, welche die Lichtstreuung beeinflussen:
- Zellgröße
- Struktur der Zellmembran
- intrazelluläre Bestandteile.

Fluoreszenz ist das durch Strahlung angeregte Leuchten eines Stoffes.

Fluoreszierende Verbindungen absorbieren Lichtenergie in einen für sie charakteristischen Wellenlängenbereich, heben dabei Elektronen in ein höheres Energieniveau und mit dem Zurückfallen zum Grundniveau emittiert das Elektron ein Photon. Diese Lichtemission wird als Fluoreszenz bezeichnet. Das Lichtspektrum, über den eine fluororeszierende Verbindung angeregt werden kann, bezeichnet man als Absorptionsspektrum. Da beim Absorptionsübergang immer mehr Energie aufgenommen wird als beim Fluoreszenzübergang emittiert wird, ist das abgestrahlte Licht langwelliger als das Anregungslicht und bildet das Emissionsspektrum.

Die Anwendungen in der Durchflusszytometrie sind sehr vielfältig, weil mehrere spezifische Fluoreszenzparameter kombiniert werden können, jede Zelle individuell analysiert wird und separiert werden kann. Über Durchflusszytometrie gibt es viele gute Bücher. Hier einige Beispiele:
• Flow Cytometry and Cell Sorting, Second Edition, Editor Andreas Radbruch (Springer Verlag 2000, ISBN 3-5406-5630-8)
• Flow Cytometry: A Practical Approach. Edited by MG Ormerod. (IRL Press, Oxford. 1994. ISBN 0-19 963461-0)
• Practical Flow Cytometry. 3rd Edition. Howard M Shapiro. (Alan R Liss, Inc. ISBN 0-471-30376-3)
• Flow Cytometry. First Principles. Alice Longobardi Givan. (Wiley-Liss, New York, 1992. ISBN 0-471-56095-2)


Laser und Fluorochrome
Im FACS werden verschiedene Laser eingesetzt.

Die Auswahl der Fluorochrome ist abhängig von der Anregungsmöglichkeit und der jeweiligen Anwendung. Die folgende Liste zeigt eine kleine Auswahl der (Haupt-) Fluoreszenzfarbstoffe und deren Anwendung.

Die Mehrfarbenfluoreszenzanalyse ermöglicht die Korrelation mehrerer Zelleigenschaften und ist somit unerlässlich für die Darstellung kleiner Subpopulationen, bei der Untersuchung der Zelldifferenzierung, der Zellproliferation und der Protein (Antigen) -expression. Neben der gemeinsamen Anregbarkeit der Farbstoffe müssen die einzelnen Emissionsmaxima deutlich voneinander getrennt sein, damit, bei der Messung mit den verschiedenen Detektoren (PMTs), nur ein minimales Übersprechen benachbarter Fluoreszenzen möglich ist.

Signalverarbeitung
Beim Passieren des Analysepunktes senden die Zellen Signale aus, die von den PMTs empfangen und die Werte mittels eines Computers verarbeitet und gespeichert werden. Die gemessenen Signale können linear oder logarithmisch dargestellt werden. Je nach seiner Konfiguration kann ein Durchflusszytometer bis zu 15 Parameter (2 Lichtstreuungen und 13 Fluoreszenzen) an einzelnen Zellen simultan messen.